拉曼分析技术

采集拉曼光谱的时间是由一系列因素决定的，包括样品自身的性质、对光谱质量的要求以及所采用的拉曼光谱仪。现代拉曼光谱仪在几秒钟的时间内足以获取一条质量很好的拉曼光谱。

在拉曼成像实验中，需要采集数千条光谱，因而需要花费更多的时间，采集时间可以从几分钟到几个小时不等。这取决于采集数据点的数量，以及上述系列因素。

因为拉曼光谱是一种非接触、无损伤的分析技术，所以可以用于高效率、自动化的批量筛分技术(HTS) 与化验分析。典型的应用包括对多孔板上的液体/ 粉末进行分析、晶体筛选以及利用透射拉曼对药物片剂的成分和均一性进行检验。

HTS 拉曼系统将样品移动、聚焦以及数据采集和分析程序的自动化集于一身，可以依次对数以百计的样品进行光谱采集。这一系统甚至可以实现全自动运行，避免了人为干预，也无需专业人员操作和分析。

目前，拉曼光谱自动化检测已应用于计算机硬盘上的类金刚石涂层分析、药物开发中的结晶度和多晶型分析，以及很多需要对大量样品进行例行分析的应用。

拉曼是一种光散射技术，激发激光和拉曼信号光都可以通过光纤传输。一束光纤用于把激光传输到样品上，另一束光纤则把样品的拉曼信号传回标准的拉曼光谱仪和探测系统。两束光纤同时连接到一个小巧紧凑的光纤探头上，探头将激光聚焦到样品上并收集拉曼信号。

新一代光纤探头可以在远离拉曼分析仪几百米远的地方进行远程测试，此外，一台拉曼分析仪可以连接多个探头，从而能在工厂里实现经济实用的多点监控。

探头还适合用在高温、高压场所，其工作模式可以是浸入型的，即分析探头浸入到反应液体中；也可以是非接触型的，此时激光是通过一个透明窗口聚焦到反应器皿或管道中，进而进行拉曼分析。

远程拉曼分析可以用于：

• 溶液/ 反应混和物
• 乳剂
• 浆状物和悬浮液
• 反应器或药瓶顶部气体分析
• 原料和体相材料给料分析
• 排放污水分析

能。拉曼是无损伤、非接触的化学分析技术，可以用来进行活体分析。通常，这是通过光纤将光谱仪、激光器与远程光纤探头耦合在一起来实现的。

活体分析的例子很多，例如分析化妆品对皮肤的作用。目前的研究主要关注拉曼光谱在外科诊疗中的应用，期待将来能够即时对人体组织的的疾病状况做出诊断。

拉曼光谱非常适合用于分析含水样品，包括溶液、生物组织和细胞等。水分子的拉曼散射截面非常小，所以拉曼散射强度也比其他分子弱很多；此外，水分子的拉曼光谱也非常简单，只有为数不多的几个拉曼峰，对于溶解物质的拉曼峰干扰甚小。
在大多数情况下，即便水分子在数量上占据很大优势，溶质的拉曼峰强度都比水的拉曼峰强度大得多。因而，分析水溶液中的溶质是轻而易举的事情。

显微拉曼光谱仪的激光光斑大小主要由两个因素确定，一是激光波长，二是所使用显微物镜的数值孔径。能够实现的最小光斑尺寸就是衍射极限，根据光学定律，激光光斑直径D 可以表示为：

D = 1.22 λ / NA

其中λ 是激发激光波长，NA 是所使用显微物镜的数值孔径。例如，采用数值孔径为0.90 放大倍数为100 倍的显微物镜，波长532 nm 激光的光斑直径理论上为721 nm。

由此公式可以看出，较短的激光波长能够提供较高的空间分辨率( 即：在使用同样的显微物镜条件下，488 nm蓝色激光的光斑就比785 nm 近红外激光的光斑小一些)，同样，数值孔径较大的显微物镜能够提供较高的空间分辨率( 即：使用同一波长激光的情况下，数值孔径0.90 的物镜的光斑就比数值孔径0.55 的物镜的光斑小一些)。

对上述公式稍作修改，就可得到衍射极限下使用光学显微镜能达到的空间分辨率R 的极限：

R = 0.61 λ / NA

对于532 nm 激光和数值孔径0.90 的物镜，理论上空间分辨率为361 nm。然而，该公式适应于标准的光学显微镜，在显微拉曼光谱仪中实际发生的光学过程则要复杂得多。例如，激光光子和拉曼光子的散射以及它们与样品表面的相互作用都会导致空间分辨率下降。因此，通常认为拉曼空间分辨率是在1 μm 左右，对于某些“优质”样品，空间分辨率可以接近衍射极限。

在诸如LabRAM HR Evolution 这样的拉曼系统中，通过引入DuoScan 光路，就可以使得激光光斑最大可以增加到270 μm x 270 μm，具体尺寸与所使用的显微物镜有关。

标准的显微拉曼光谱仪其激光光斑一般在0.5 μm~1.0 μm 范围内( 受限于显微物镜数值孔径和激光波长)。这样小的激光光斑对于分析样品的微观特征来说是很理想的，与真共焦光路相结合，可以提供优良的空间分辨率，但是对于测量大块体相样品来说，就可能受到局限。

显微拉曼光谱仪的空间分辨率主要由两个因素确定，一是激光波长，二是所使用的物镜的数值孔径。根据光学定律，衍射极限下使用光学显微镜能达到的空间分辨率R可以表示为：

R = 0.61 λ / NA

其中λ 是激发激光波长，NA 是所使用物镜的数值孔径。例如，采用数值孔径为0.90 的物镜，在532 nm 激光激发下，理论上空间分辨率为361 nm。然而，该公式是基于标准的光学显微镜的，而在显微拉曼光谱仪中实际光学过程则要复杂得多。例如，激光光子和拉曼光子的散射以及它们与样品表面的相互作用都会导致空间分辨率下降。因此，通常认为拉曼空间分辨率约为1 μm 左右，然而，对于某些“优质”样品，空间分辨率可以接近衍射极限。

由公式可以看出，较短的激光波长能够提供较高的空间分辨率( 即：在使用同样的物镜条件下，488 nm 蓝色激光的光斑就比785 nm 近红外激光的光斑小一些)，同样数值孔径较大的物镜能够提供较高的空间分辨率( 即：使用同一波长激光的情况下，数值孔径0.90 的物镜的光斑就比数值孔径0.55 的物镜的光斑小一些)。

值得注意的是，以上公式中涉及到的是横向(XY) 的空间分辨率，纵向(Z) 空间分辨率更为复杂一些，取决于所采用显微拉曼光谱仪的共焦设计。现今投入使用的共焦设计有几种，其中一些是真共焦的，而另一些是赝共焦的，其实际效果也不尽相同。真共焦设计在光路上安装可以调节的共焦针孔光阑，可以达到1 μm~2 μm 的纵向分辨率，可以逐层分析多层薄层样品，即可以在纵向进行拉曼切片。最终能达到的纵向分辨率由激光波长、显微物镜和样品的结构决定。