仪器

HORIBA SPRi仪器基于Kretschmann构型，通过棱镜实现。

准直光束通过棱镜照向整个功能化的金表面，覆盖所有点样点。无需对其进行二维扫描。

在芯片上反射后，光束被探测器的成像传感器（二维阵列）获取，每个像素对应于 SPRi-Biochip 生物芯片上的给定位置。

HORIBA Scientific 的专有光学构造实现了一个简单且准确的成像系统，除扫描镜外，无任何其他移动。

扫描镜的旋转方便选择针对特定共振角的工作角，以进行动力学测量。工作角（记录动力学曲线的位置）设置为反射率曲线的最高斜率处。

动力学测量包括同时监测多达几百个样点的反射率随时间的变化。

传统的 SPR 系统可并行监控少量的相互作用。成像系统由于采用了一种特殊的流通池，能够并行监测多达数百个相互作用。

通道的数量对应于可以固定的不同配体的数量。配体通过微流体系统被固定在系统中。微流体所需的样品量更少，但对某些应用（血清、血浆、细胞等）具有局限性。成像系统的流体结构可研究粗提样品，而不会造成流通池或流体部件堵塞。

此外，与其他技术（如质谱）的耦合在通道系统中更为复杂。通道系统需要多次回收样品并浓缩，增加了实验步骤，还可能造成样品污染和/或样品损失的风险。HORIBA Scientific让 SPRi-MS 更加直接，并且效率更高。另外，专属生物芯片设计可以直接在生物芯片上识别分析物，无需回收步骤。

多重分析和通道形式对比：

HORIBA Scientific的 SPRi 仪器一个工作日相当于使用通道型仪器 3 个月。

单次运行可提取高通量信息。例如，使用单个 SPRi-Biochip 生物芯片，可以优化相互作用的实验条件（固定化浓度、固定化pH值、固定化缓冲液等）和/或同时筛选不同的配体。多重分析可以节省时间并降低耗材成本。

通过探测器成像可以同时监测生物芯片整个表面的共振情况。生物芯片的所有点样点（流通池图像）和注入分析物后这些点样点发生相互作用的过程（差减图像）都可以完整观察。

在传统的 SPR 装置中，配体被注入 SPR 系统，并被直接固定在通道中。对于SPRi仪器，配体需要用自动或手动点样仪在仪器外进行固定，因为系统以阵列形式工作，不适合在 SPRi 仪器内部进行生物芯片表面点样。微阵列点样允许更高通量的配体固定。

使用大通路微流控技术可以分析复杂溶液和粗提样品。这为开发新的应用和分析杂交瘤、血清^7,8、唾液⁹、牛奶¹⁰等样品开辟了道路。

Instead of injecting different analyte concentrations (“classical” analysis), we immobilize different ligand concentrations on the biochip surface, and we inject the analyte at one concentration (“Single injection” analysis). Dedicated software allows then determining kinetic constants and calculating the affinity of the interaction.

如果需要更换配体则不能。因为配体通常共价固定在 SPRi-Biochip 生物芯片上，无法去除。但是，通过再生液的使用，可以在同一个 SPRi-Biochip 生物芯片表面注入多个不同的样品。

这一步意味着打破配体和分析物之间的特异性结合。根据所研究的生物分子，可以使用以下溶液：

• 阳离子螯合剂：EDTA
• 高离子强度：NaCl 1 M, MgCl₂ 2 M
• 低pH值：Glycine-HCl 100 mM pH 2, HCl 10-100 mM
• 高pH值：Glycine-NaOH 100 mM pH 9.5, NaOH 10-200 mM

表面经设计可以耐受这些再生液，并且当配体以合适方式固定到芯片表面时，可以设计数个连续的相互作用再生步骤。再生次数取决于配体和分析物之间的亲和力以及配体的稳固性。

SPR 实验在缓冲液中进行。缓冲液在仪器内持续循环。根据配体/分析物相互作用，缓冲液的成分依据能否凸显特异性结合选择。建议使用盐缓冲液，如 PBS（磷酸盐）、HEPES（乙磺酸） 或柠檬酸盐。缓冲液的成分、浓度或酸碱度必须根据所研究的生物分子调整。

可以探测低至约 200Da 的小分子（直接检测）。小分子的成功检测取决于相互作用模型和实验条件。

小分子检测（动力学曲线和亲和力测定）。

^{图 12-13：小分子检测（动力学曲线和亲和力测定）。}

样品溶液使用传统的流体系统（不含微流控通道）注入；因此，可以注入高浓度的样品溶液，如血清、细胞裂解物和血浆。

也可以将来自粗提样品的蛋白质固定在生物芯片表面上。通过捕获抗体和有效的交联步骤，可以防止蛋白质在再生步骤中从生物芯片表面解偶联。我们称之为点样多步固定。

SPRi 和 MALDI-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI-TOF）之间的偶联非常简单。在同一个 SPRi-Slide 玻片式芯片上可以进行这两种分析。

完成 SPRi 相互作用后（使用质谱兼容条件，例如缓冲液、化学试剂等），从 SPRi 系统中取出 SPRi 玻片式芯片。在每个单独的点样点上都进行基质沉积和酶消化。然后将 SPRi 玻片式芯片放在 MALDI 靶板支架上，直接在芯片表面进行质谱分析。分析过程无需长时间洗脱，避免了样品损失或样品污染^{16,17, 18, 19}。

MALDI-MS 适用于多糖、肽分析、小分子量或消化蛋白质片段、聚合物、DNA 或有机化合物。

SPRi-MS 可以成功表征由原位消化蛋白质产生的蛋白质和肽。

SPRi-MS 实验的每一步都在同一个 SPRi-Slide 玻片式芯片表面进行。SPRi 玻片式芯片表面可用于配体固定化、特定分析物捕获、原位消化（如必要）和 MALDI-MS 分析。