荧光光谱的基本理论

荧光是由光子激发分子，使其达到电子激发态后为回到基态而产生的发光。它是由单重态基态的光子吸收提升到单重态激发态而产生的。当被激发的分子返回基态时，会发射一个比被吸收光子能量更低的光子，对应于更长的波长。

荧光光谱学使用一束光来激发某些化合物分子中的电子，并使它们发光。光通过单色仪进入检测器被检测，用于测量和识别分子或分子的变化。

图. 3 雅布朗斯基图 (Jablonski, 1933), 该图阐述了在荧光现象中电子态之间跃迁的原理。左边坐标轴向上能量增加，这里给出了一个典型的荧光分子的吸收光谱。从光谱中可以看出分子吸收光子的能量或波长所在。

简单地说，分子的荧光寿命可以被认为是它在激发态 所存在的平均时间长度。这个时间长度又依赖于分子的类型以及分子所处的局 部环境。通常情况下，激发态的时间衰减是指数形式的， 如下面的公式所示。较之荧光强度测量，使用荧光寿命具 有其优势 : 荧光寿命是一种“绝对”测量，而不是强度那样的“相对”稳态测量 ( 一个时间平均信号 )。

I(t) = I₀ exp^(-t/τ)

以上公式中，τ 就是荧光寿命，即荧光强度衰减为其 初始值的 1/e 的时间。

有时，由于所研究样品中包含多种 荧光分子，或者由于荧光分子处于不同的局部环境中，也 可能是分子正处于某种变化之中，都会导致出现多个激发态。此时的荧光衰减过程就更为复杂。每个激发态都会存 在一个指数形式的衰减。

此时的荧光强度可以表示为多个指数衰减函数的总和的形式（下图），式中各个指数函数前面的系数 α 就代表每一项 τ 衰减对于所观察到的总的荧光衰减所占的相对比例。

为了方便比较每一种荧光物种的浓度，经常把系数 α 进行归一化处理；然而需要比较各自对稳态光谱（总荧光 辐射）的贡献时，则使用分数或相对大小幅度（以百分数 表示）。而有时，能够被接受的方法则是，用平均寿命来 表示一个复杂的衰减过程。然而需要注意的是，最好的方法是正确地模拟复杂的衰变，而不是仅仅试图将其拟合为单个的指数衰减形式。

大多数情况下，采用相对大小平均寿命是合适的。然而，在涉及到猝灭实验时，更好的办法是使用强度平均的荧光寿命。在一些已出版的著作里 (Lakowicz, 2006)、 (Berezin, 2010)，对于这些种类的平均方法各自的优势有着比较详尽的讨论。

在磷光过程中，光子是从一个禁戒的三重态，而非单 重激发态，辐射出来的。荧光辐射的时间尺度通常落在皮 秒到纳秒的范围内；而磷光的持续时间则可以是微秒、毫 秒或者更长……，直至分钟或小时。 测量磷光光谱及其在这样较长时间尺度上的衰减时， 通常使用脉冲光源，例如频闪灯或者 LED。

磷光测量使用长寿命的脉冲光源，例如充氙气的闪烁 氙灯。闪烁氙灯的计时功能可以用来在不同的磷光寿命下 测量光谱，也可以获得延迟光谱。