什么是荧光各向异性 ?

吸收和发射分别对应于荧光分子的偶极矩与激发光或 发射光（电磁波）的电矢量之间的空间位置的关系。 换言之，如果用垂直偏振光激发荧光基团，那么发射 光所保留的垂直偏振的程度将取决于这些荧光基团在溶液 中自转的快慢程度。荧光基团在溶液中这种重新定向的运 动越快，发射光的退偏振度就越高；反之，荧光基团在溶 液中重新定向的运动越慢，发射光所保留的偏振度就越高。

要测量荧光的各向异性信息，必须在荧光光谱仪的激 发光光路和辐射光光路都放置偏振片，来对所使用或探测 的光进行选择。各向异性度是利用偏振光强度比值计算出 来的，如上面公式所示。公式中，I_VV 代表在垂直偏振光 激发下，探测到的垂直偏振的发射光的强度。I_VH 代表在 垂直偏振光激发下，探测到的水平偏振的发射光的强度。 G 是光栅校正因子，用于校正仪器系统对不同偏振方向的 光的响应差异。

实验的基本原理是这样的：首先，激发光路和发射光 路中的偏振片都转动到垂直位置进行测量，测到的荧光强 度即 I_VV；然后将发射光路中的偏振片都转动到水平位置 测量荧光强度 I_VH。

各向异性公式中的因子“2”的出现是因为有两种正 交取向配置，VVz 的配置可以投影为 Hx 和 Hy 两种，因 而有两个 IVH 成分。与之有关的是，偏振度 p 常用来描述 只有一个水平分量的二维偏振参数，在此情况下，公式中 就没有因子“2”，而偏振度 p 则代替了各向异性度 r。

再者，因子 G 是通过分别测量 HH 和 HV 偏振配置下 的荧光强度计算出来的。由脚标 r 代表的各向异性，常用 来作为分子尺寸、分子扩散和分子黏度的标识。

上页右下图中给出了用于分析荧光各向异性结果的几 个公式。前面已经讨论了荧光各向异性的基本公式，它们 也可以用来计算荧光衰减整体过程，给出时间分辨的荧光 各向异性结果（上图）。从时间分辨的荧光各向异性，可 以得出分子取向重排时间常数，然后根据 Perrin 公式和 Stokes Einstein Debye 公式估算扩散系数、局部黏度以及 分子体积等属性。

在研究蛋白质或分子结合、聚合物聚合， 以及研究其它复杂的溶液或材料中的局域环境时，这些属 性对应着非常重要的信息。例如，通过荧光各向异性，可 以清楚地观察到 BSA 蛋白质去折叠行为的温度依赖性， 如下图所示，这里就利用了本征色氨酸残基的荧光各向异 性

荧光动力学意味着观测荧光强度随着时间的变化，在 此，样品为单一波长的光激发，同时在单一波长位置探测 发射光随时间的变化。有时也使用成对的波长，例如测量 比率计染料或者同时记录基线或背景信息。

如下图所示， 利用基于时间的测量可以跟踪反应速率。借助于 CCD 的 优点，现在也可以获得波长 - 强度 - 时间的三维动力学研 究，相比常规的方法，既可以得到强度随时间的变化，也 可以得到发射波长随时间的变化，这对于动态研究提供了 另一个维度。本例研究的就是，使用不同浓度的硫胺素条 件下，硫胺素与汞结合形成脱氢硫胺素的反应速率。每 一次动力学扫描都代表不同反应速率的脱氢硫胺素形成反 应。

分子间相互作用的荧光动力学测量经常要使用一种快 速混合附件，称为“停流”附件（stopped flow）。停流 可以在几个毫秒的时间内把两种或多种溶液混合在一起， 这样就不受扩散效应影响，在非常接近零混合时间下，记 录分子的结合和反应。

下图给出的是一种叫做 ANS 的荧光基团，与 BSA 蛋 白的结合的例子。ANS 的荧光强度会由于与 BSA 蛋白的 结合而增加，因而可以利用荧光动力学测定二者结合的速 率。本例中，ANS与BSA蛋白结合的速率大约为400毫秒。

有两种附件可以用于控制荧光光度计中样品的温度： 循环水浴和基于珀尔帖效应的半导体制冷器件。

荧光光谱系统的标准样品池支架上有两个端口可以 连接循环水浴制冷，从而使得样品池的温度在 -20° C 至 80° C 范围内可控。另一种替代方法是使用珀尔帖装置控 制的样品池基座，这种方式使得样品池的温度在 -25° C 至105°C范围内可控，并且与水浴相比其温度响应更快速。 二者的不同之处在于，珀尔帖装置能够更精确地控制温度， 相比之下循环水浴系统则往往是先窜到设定温度之上，然 后再降下来。循环水浴系统适合于到达设定温度然后保持 不变进行实验，而珀尔帖温控装置更适合于在一定范围内 多个不同温度点对样品进行测量，或者是测量对温度变化 特别敏感的样品。

此外，还可以选择使用恒温容器和固定工具套装，这 些工具套装适合于不同型号的液氮和液氦恒温容器。除了 制冷之外，大多数恒温器也可以加热至 500K 乃至更高的 温度。